Kidd 혈액형군은 Jk^a, Jk^b와 Jk3 항원으로 구성되어 있으며, Kidd 혈액형은 임상적으로 용혈수혈반응 및 태아신생아용혈성질환을 일으키는 빈도가 비교적 높은 혈액형이다[1-3]. Kidd 혈액형군의 유전정보는 SLC14A1 (Solute Carrier Family 14 Member 1)유전자에 있으며, SLC14A1 rs1058396 변이에 따라 JK*01과 JK*02로 유전형이 결정된다[1]. 이 단일염기변이를 검출하기 위해 PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) [3,4], Allele-specific PCR [5,6], SNaPshot [7]과 real-time PCR [8] 등 다양한 기법이 소개되어 JK 유전형을 판정하는데 이용되고 있다. 이 중 PCR-RFLP 기법은 여러 단계의 검사 과정과 긴 검사시간이 필요한 단점이 있지만[9], 검사 최적화가 단순하고 비싼 장비가 필요 없으며 검사시약이 비교적 저렴한 장점이 있어서 여전히 여러 연구에 이용되고 있다[10,11]. Real-time PCR를 이용하면 전기영동과 같은 추가적인 과정 없이 PCR만으로 유전형를 확인할 수 있으므로 신속하며 대용량 검사에 적합하다. 하지만 비싼 real-time PCR 장비가 필요한 단점이 있다. 따라서, 연구 목적에 따라 적합한 기법을 선택하는 것이 필요하다[12].

PCR-RFLP를 이용한 기존 SLC14A1 rs1058396 유전형 연구에서 MnlI 제한효소를 이용하였는데 이 경우 100 bp 이하의 작은 길이의 제한효소 절편들을 구분하기 위해 polyacrylamide 겔과 같은 고해상도 겔을 이용하였다[3,4]. Lithium borate buffer (LBB)으로 전기영동을 실시하면 범용 아가로스 겔로도 100 bp 이하 작은 크기의 표적을 구분할 수 있다는 여러 보고가 있다[12,13]. 이에 저자는 LBB와 범용 아가로스 겔로 Kidd 유전형 검사를 위한 PCR-RFLP 기법을 개발하여 문헌고찰과 함께 이를 보고하고자 한다.

1.검체 및 DNA 추출

2022년 10월동안 수집된 72개의 폐기예정인 K₂EDTA 처리된 혈액검체에서 모든 식별자를 제거한 후 QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 회사 지침에 따라 DNA를 추출하였다.

2.PCR 시발체 디자인 및 점검

PCR 시발체 디자인을 위한 DNA 염기서열은 NG_011775.4를 이용하였으며, 시발체 디자인 웹프로그램인 Primer3 [14]를 이용하여 디자인하였다. Primer-Blast 웹프로그램[15]을 이용하여 디자인된 시발체가 의도하지 않은 주형에 결합하여 비특이적 증폭산물이 발생할 가능성을 평가하였고, 디자인된 시발체의 SLC14A1 결합부위에 위치하는 염기서열 변이에 대해 dbSNP 데이터베이스[16]를 이용하여 검증하였다.

3.PCR 및 제한효소 처리

PCR 반응액은 2X EmeraldAMP GT PCR Master Mix (Takara, Shiga, Japan) 10 mL, DNA 1 mL, KiddRFLPF (5'-CCTGCCTTTAGTCCTGAGTTC-3') 및 KiddRFLPR (5'-GCCAGAGAGCTGTTGAAACC- 3') 시발체 각 0.5 mM 및 증류수를 첨가하여 총 20 mL가 되도록 하였다. Veriti 96-Well Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 gradient PCR를 실시하여 최적 결합온도(annealing temperature, Ta)를 찾아 다음 조건으로 PCR을 진행하였다. 98℃에서 1분간 처리한 후에 98℃ 10초, 55℃ 10초, 72℃ 30초씩 35회 증폭하였다. 정제하지 않은 PCR 산물에 MnlI (NEB, Ipswich, MA, USA) 5 U를 첨가하고 37℃에서 1시간 처리하였다.

4.전기영동

붕소리튬산화물(lithium tetraborate, anhydrous; Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA)을 이용하여 제조한 1 mM lithium borate buffer (LBB)와 범용 아가로스인 SeaKem LE Agarose (Lonza, Rockland, ME, USA)를 이용하여 3% 아가로스 겔을 만들었다[12]. 전극간 길이가 20 cm인 전기영동 챔버에 1 mM LBB를 채운 후 3.0% 아가로스 겔의 각 well에 MnlI으로 처리된 각 증폭산물 10 mL를 분주하고 300V 전압을 걸어 30분간 전기영동을 하였다. MnlI의 인식부위는 5’-CCTC-3’이며, 인식부위 3’ 끝 염기인 cytosine으로부터 7번째 염기에서 절단된다. 본 연구에서 이용된 시발체로 증폭된 증폭산물을 MnlI 처리하면 JK*01/*01은 51 bp, 36 bp, 21 bp로 절단되고, JK*02/*02는 72 bp와 36 bp로 절단되며, JK*01/*02는 72 bp, 51 bp, 36 bp와 21 bp로 절단된다. 51 bp는 JK*01의 표적으로, 72 bp는 JK*02의 표적으로 활용하였다.

5.염기서열분석

PCR 반응액은 2X EmeraldAMP GT PCR Master Mix (Takara) 10 mL, DNA 1 mL, KiddSeqF (5'-CATT GTAGGAGTTYGTGGGTGT-3') 및 KiddSeqR (5'-ATCAGAGAGGTAGGCAGAGGTG-3') 시발체 각 0.5 mM 및 증류수를 첨가하여 총 20 mL가 되도록 하였다. Veriti 96-Well Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific)로 gradient PCR을 실시하여 최적 Ta를 찾아 다음 조건으로 PCR을 진행하였다. 98℃에서 1분간 처리한 후에 98℃ 15초, 63℃ 30초, 72℃ 1분씩 35회 증폭하였다. ExoSAP-IT^TM PCR Product Cleanup Reagent (Thermo Fisher Scientific)로 정제 후 BigDye^TM Terminator v3.1 Cycle Sequen-cing Kit (Thermo Fisher Scientific)와 ABI 3730XL (Thermo Fisher Scientific)으로 분석하였다.

1.시발체 디자인과 점검

Primer3 웹프로그램으로 디자인한 PCR-RFLP를 위한 시발체 한 쌍과 염기서열분석을 위한 시발체 한 쌍을 Primer-Blast 웹프로그램으로 점검한 결과 비특이적 증폭산물이 나올 가능성이 낮을 것으로 판단하였으며, dbSNP b155 v2의 Live RefSNPs 데이터베이스를 통해 시발체 결합부위에 총 34개의 SNP가 확인되었으며, 0.1% 이상의 빈도로 관찰되는 SNP는 KiddSeqF 시발체 결합부위에 rs473429 (NG_011775.4:g.57071T>C) 하나만 있었다. 이를 반영하여 Kiddrs1058396SeqF 시발체의 3’ 끝에서 9번째 염기를 Y로 치환하고 합성하여 본 연구에 이용하였다. 위에 기술된 PCR 조건에서 모두 단일 밴드가 관찰되었고 증폭량도 충분하였다.

2.PCR-RFLP 결과

72명 모두 증폭되었으며, JK*01/*01은 16명(22.2%), JK*02/*02는 19명(26.4%), 그리고 JK*01/*02는 37명(51.4%)이었다. 표적 제한효소 절편을 쉽게 구분할 수 있었다. 약간의 smiling 효과가 밴드에서 관찰되었으나, 해석에 영향을 끼치지는 않았다(Fig. 1).

Fig. 1. Results of PCR-RFLP using general-purpose 3.0% agarose gel and lithium borate buffer for the Kidd genotyping in 16 out of 72 samples. Lane M; 20 bp size ladder (Takara, Shiga, Japan), Lane 8, 11, 12, 15; JK*01/01, Lane 1, 2, 3, 4, 5, 10, 13, 14, 16; JK*01/02, and Lane 6, 7, 9; JK*02/*02. The results obtained with the PCR-RFLP were completely in agreement with the results of PCR-direct sequencing.
Abbreviation: PCR-RFLP, polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism.

3.PCR-RFLP 결과와 염기서열분석법 결과 비교

염기서열 분석 결과 JK*01/*01은 16명(22.2%), JK*02/*02는 19명(26.4%), 그리고 JK*01/*02는 37명(51.4%)이었으며, 이 결과와 PCR-RFLP 결과는 동일하였다.

Kidd 혈액형군(ISBT009)은 9번째로 동정된 혈액형군[17]으로 1951년 신생아용혈성질환을 가진 여섯 번째 아들을 출산한 Kidd 부인의 동정되지 않은 항체에 대한 연구로 Jk^a 항원을 발견하였다[18]. Kidd 항원의 약어로 Jk를 사용하는데, 이는 아들 이름 John Kidd의 첫 글자에서 따왔다[19]. 1953년 용혈수혈반응이 발생한 W 부인의 혈청에서 anti-Jk^b를 발견하면서 Jk^b 항원을 동정하였다[20]. 1959년 용혈수혈반응이 발생한 S 부인의 적혈구가 anti-Jk^a와 anti-Jk^b에 결합하지 않았고, S 부인 혈청과 657명의 적혈구가 모두 응집이 발생하여 Jk (a-b-) 혈액형을 보고하였다[21].

면역혈액학적으로 Kidd 혈액형을 표현하는 단백질은 B형 요소 수송체(type B urea transporter, UT-B)인 SLC14A1 당단백질이다. SLC14A1 당단백질은 막관통단백질(transmembrane protein)으로서 요소가 세포막을 가로질러 수동수송(passive transport)하도록 촉진한다[22]. SLC14A1 단백질은 신수질(renal medulla), 뇌, 심장, 췌장, 대장, 방광 및 골수 등 다양한 조직에서 발현한다. SLC14A1 단백질은 요소 농도를 유지하고 남성 생식기능, 혈압, 골대사, 뇌 기능 및 심장 기능과 연관있다. 쥐에서 SLC14A1 결핍은 방광 상피 세포의 세포사멸(apoptosis)의 민감도를 높이며, SLC14A1 단백질이 제거된 쥐(SLC14A1-null mice)는 방실차단(atrioventricular block)과 우울증이 발생했다고 한다[23].

SLC14A1 유전자는 18q12.3에 위치하며, 약 30 kbp의 길이에 걸쳐 엑손 4번부터 엑손 11번까지의 코딩부위를 포함한 11개의 엑손으로 구성되어 있다[2]. JK*01과 JK*02를 구분하는 rs1058396 변이는 엑손 8번에 위치하며, DNA, mRNA 및 단백질 수준에서 NG_011775.4:g.57530G>A, NG_011775.4 (NM_015865.7):c.838G>A 및 NP_056949.4:p. (Asp280Asn)에 위치하고 있다[24]. rs1058396 변이는 Kidd 혈액형 뿐만 아니라 방광암과도 연관있다는 보고가 있다[22].

최적의 시발체를 디자인하기 위한 다양한 무료 소프트웨어가 있다[25]. 본 연구에서 시발체를 디자인하기 위해 Primer3 웹프로그램을 이용하였다. Primer3 웹프로그램은 시발체의 길이, 상보성, 2차 구조 및 Tm 값 등을 세밀하게 세팅하여 시발체를 디자인할 수 있으나[26], 시발체의 비특이적 결합 가능성과 결합 부위의 변이 여부는 확인할 수 없다. 따라서 저자는 비특이적 증폭산물의 가능성을 평가하기 위해 Primer-Blast를 이용하였다. Primer-Blast에 시발체를 디자인할 수 있는 기능이 있으나, 저자는 Primer3가 익숙해서 Primer3를 이용하였다. 시발체 결합부위에 변이가 존재하면 원치 않는 대립유전자특이 PCR을 실시하게 되어 한 대립유전자만 증폭될 수 있다. 따라서, 시발체 디자인 후 결합부위에 빈도가 비교적 높은 변이가 있는지 살펴봐야 한다.

MnlI 제한효소를 이용한 기존 PCR-RFLP 기법에서 polyacrylamide gel을 이용했는데[3,4] 이는 polyacrylamide gel의 공극 크기(pore size)가 일반적인 아가로스 겔의 공극보다 작아 100 bp 이하의 작은 DNA 절편을 구분하기 용이하기 때문이다[27]. Acrylamide는 신경독성이 있고 polyacrylamide 겔을 만드는 과정이 복잡한 단점이 있다[9]. LBB를 이용하면 범용 아가로스 겔로 100 bp 이하 크기의 DNA 가닥을 구분할 수 있으며, 신경 독성이 없고, 겔 만드는 과정이 단순하고 가격이 싼 장점이 있다[12]. 범용 아가로스 겔로 이와 같은 효과를 얻을 수 있는 것은 LBB의 리튬의 특성에 의한 것이다. 리튬은 알칼리 금속 중에서 가장 낮은 전류를 발생해 고전압을 걸었을 때 아가로스 겔의 온도 상승이 적고 smiling 효과와 같은 DNA 밴드의 변형을 별로 일으키지 않는다[13]. Tris-borate-EDTA 버퍼와 같은 일반적인 전기영동 버퍼에 300 V 고전압을 걸면 DNA 밴드에 강한 smiling 효과가 보이지만, LBB를 이용한 본 연구에서는 PCR-RFLP 결과 판독에 영향을 주지 않는 약한 smiling 효과만 관찰되었다.

본 연구에서 Kidd 유전형이 JK*01/*01는 22.2% (16/72), JK*02/*02는 26.4% (19/72), 그리고 JK*01/*02는 51.4% (37/72)로 나왔는데 이는 한국인을 대상으로 한 기존 보고와 유사한 수준이다[3]. rs1058396 변이를 검출하는 본 연구로는 JK:-3 (Jk [a-b-])를 검출할 수 없다. JK*01N과 JK*02N을 유발하는 DNA 변이는 JK*01에서 23개와 JK*02에서 22개가 알려져 있으며, 단일염기변이, splicing variant 및 small deletion에 의한 것이다[28]. Kim 등[29]은 12,250명 헌혈자를 대상으로 JK:-3는 한 예도 발견하지 못하였다고 하였다.

본 연구에서 LBB와 범용 아가로스 겔와 기본적인 분자검사 장비만으로 실시한 PCR-RFLP를 이용하여 SLC14A1 rs1058396를 검출하였으며, 이 기법은 정확하고 신뢰할 만한 검사 기법으로 사료된다.

배경: 지연성용혈수혈반응과 태아신생아용혈성질환을 예방하기 위해 Kidd (SLC14A1 rs1058396) 유전형 검사는 중요한 검사이다. MnlI 제한효소를 이용하는 PCR-제한효소절편길이다형성(restriction fragment length polymorphism, RFLP) 기법은 polyacrylamide gel을 이용해야 하므로 널리 이용하지 않고 있다. Polyacrylamide gel을 대신하여 범용 아가로스 겔과 리튬붕산염버퍼(lithium borate buffer, LBB)로 전기영동을 실시한 PCR-RFLP를 개발하였다.

방법: 72개 정맥혈 검체를 무작위로 수집하고 본 연구에 이용하였다. 짧은 길이의 제한효소 절편(72 bp, 51 bp, 36 bp 및 21 bp)을 구분하기 위해 1 µg/mL의 ethidium bromide를 함유한 3% 아가로스 겔과 1 mM LBB, 그리고 고전압(300 V)을 이용하였다. PCR-RFLP 결과를 PCR-직접염기서열분석법으로 확인하였다.

결과: 표적 제한효소 절편을 쉽게 구분할 수 있었다. PCR-RFLP 결과와 PCR-직접염기서열분석법의 결과는 완전히 일치하였다.

결론: 범용 아가로스겔과 LBB를 이용한 PCR- RFLP는 정확하고 신뢰할 수 있는 Kidd 유전형 검사법이다.