ABO 유전형 검사는 9번 염색체 장완에 위치한 ABO 유전자를 분석하여 그 유전형을 결정하는 검사이다. 이는 국내외 의료기관에서 혈청학적 검사만으로는 ABO 혈액형을 정확히 규명하기 어려운 ABO 아형 등에 의한 ABO 불일치 해결을 위해 주로 사용되어 왔다[1-4]. 그런데, 일부 ABO 아형은 ABO 유전형 검사로 그 유전적 원인이 규명되지 않았다. 이는 ABO 유전자 중 엑손 6과 7만을 주로 분석했기 때문으로 판단되어, 최근 근접 프로모터 및 인트론 1 ＋5.8 kb 부위의 변이를 추가로 분석하여 기존 검사의 한계를 일부 극복하고 있다[5-11].

국내 한 의료기관에서 ABO 유전형 검사의 경험을 보고한 지 10년이 지났다[12]. 그 후 ABO 불일치의 원인 규명도 다양해지고, ABO 유전자 분석 범위도 확장되었으며, 차세대염기서열분석(Next generation sequencing, NGS) 같은 새로운 기법도 적용되고 있다[11]. 그런데, 이처럼 변화된 ABO 유전형 검사에 대한 의료기관의 경험에 대한 체계적인 추가 보고가 그간 없었다. 따라서, 본 연구에서는 최근 5년간 삼성서울병원에서 경험한 ABO 유전형 검사 결과를 후향적으로 분석하여, ABO 유전형 검사의 임상적 활용 경험 및 ABO 아형의 분포를 보고하고자 한다. 

1.대상

2017년 8월부터 2022년 7월까지 총 5년 간 삼성서울병원에 ABO 유전형 검사가 시행된 265 검체를 후향적으로 분석하였다. 모든 검체는 ABO 유전형 검사를 시행하기 전에 혈청학적 검사를 시행하였고, 필요 시 비예기항체 선별 및 동정 검사를 실시하였다. 모든 검체에 대하여 엑손 6과 7을 분석하였고, 이 중 2022년 5월 9일 이후 접수된 검체 17건에 대해서는 근접 프로모터 및 인트론 1 ＋5.8 kb 부위에 대해 추가로 직접염기서열분석법을 시행하였다. 타 기관에서 의뢰된 검체는 동봉되는 유전검사의뢰서를 통해, 본원 환자는 전자의무기록으로 환자의 성별, 나이, 의뢰 사유 및 혈청학적 검사 결과를 파악하였다. 본 연구는 삼성서울병원의 임상시험심사위원회의 승인을 받아 진행되었다(승인번호: SMC-2022-08-084).

2.ABO 혈액형의 혈청학적 검사

ABO 혈액형은 QWALYS-3 (Diagast, Loos, Fra-nce), Galileo NEO (Immucor, Norcross, GA, USA), 혹은 VISION Max (Ortho Clinical Diagnostics, Ra-ritan, NJ, USA)의 자동화장비로 검사하였고, 수기법으로는 아크릴 타일법, 표준 튜브법 및 15분 항온 후 응집 정도를 판독하는 방법(이하 15분 지연법) 방법을 활용해 종합적으로 ABO 혈액형을 결정하였다. 아크릴 타일법으로는 혈구형 검사만 시행하였고 anti-A, anti-B (Merck Millipore, Darmstadt, Germany) 시약을 사용하였다. 표준 튜브법 및 15분 지연법은 혈구형 검사에 anti-A, anti-B (Shinyang Diagnostics, Siheung, South Korea), anti-A1 lectin (Lorne Laboratorie, Reading, UK) 시약을 사용하였고, 혈청형 검사에 A1, B cell (Ortho Clinical Diag-nostics)을 사용하였다.

혈청 측 과잉 반응을 보여 비예기항체가 의심되는 경우, 선별검사를 우선 시행하였는데 LISS/ Coombs card (Bio-Rad, Cressier-sur-Morat, Switzer-land)상에서 환자 혈청과 ID-DiaCell I, II (Bio- Rad)을 반응시켜 응집 정도를 확인하였다. 선별검사 양성인 경우, ID-DiaPanel (Bio-Rad)과 RE-SOLVE Panel A (Ortho Clinical Diagnostics)를 활용해 비예기항체 동정 검사를 시행하였다.

3.ABO 불일치

혈구형 검사 상 타일법에서 응집 강도가 약하거나 혼합 시야 반응이 나타나는 경우, 표준 튜브법에서 응집 강도가 3＋ 이하인 경우, 적혈구 항원 약화로 판정하였다. 혈청형 검사 상 표준 튜브법에서 응집 강도가 2＋ 이하인 경우, 혈청 측 반응 약화로 판정하였다. ABO 불일치의 판독 기준과 원인은 AABB (American Association of Blood Banks) Technical Manual [13]에 근거하였다.

4.ABO 유전형 검사

MagNA Pure 96 DNA isolation kit (Roche, Basel, Switzerland)를 사용하여 EDTA 튜브에 담긴 전혈 검체에서 genomic DNA를 추출하였다. 보고된 시발체 정보를 활용하여 중합효소연쇄반응(Polyme-rase chain reaction, PCR)을 통해 ABO 유전자의 엑손 6, 7번, 근접 프로모터, 그리고 인트론 1 ＋5.8 kb 부위를 포함하는 증폭 산물을 얻었다[9,10,12]. PCR product pre-sequencing kit (Applied Biosys-tems, Waltham, MA, USA)를 사용하여 정제하였다. 염기서열분석은 BigDye Terminator v1.1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems)를 사용하여 PCR을 진행한 후 3730xl DNA analyzer (Applied Bio-systems)로 자동분석하였다. 분석 결과를 SEQUE-NCHER (Gene Codes Corp, Ann Arbor, MI, USA) software를 통해 대조 염기서열인 ABO*A1.01 allele와 비교하여 판독하였다. ABO 대립유전자는 ISBT (International Society of Blood Transfusion)의 혈액형 대립인자 표(v1.2)에 따라 명명하였다[14].

1.ABO 유전형 검사 의뢰 사유

5년 동안 의뢰된 265개 검체들의 의뢰 사유를 Table 1에 정리하였다. 의뢰된 검체의 89.8% (238/ 265)에서 ABO 불일치가 확인되었고, 이 중 84.9% (225/265)는 외부기관, 4.9% (13/265)는 본원에서 의뢰되었다. 나머지 10.2% (27/265)는 ABO 불일치 현상이 없었는데, 이 중 8.7% (23/265)는 의뢰 사유 파악이 어려웠고, 1.1% (3/265)는 ABO 아형 가족 검사로 의뢰된 정상 표현형 검체였으며, 0.4% (1/265)는 검사 시기에 따라 다른 혈액형을 보여 본원에서 의뢰된 검체였다.

Table 1

.Causes for ABO genotyping request for 265 cases

Cause of request	Requesting institution		Total, % (N)
	External request, % (N)	Internal request, % (N)
ABO discrepancy	84.9 (225/265)	4.9 (13/265)	89.8 (238/265)
Others*	9.8 (26/265)	0.4 (1/265)	10.2 (27/265)

*Among the 27 ABO non-discrepant cases, 23 cases were requested with unknown cause, 3 cases for a family study on the ABO subgroup (a sister with cisAB allele, a mother with cisAB allele, and a daughter with AW.10 allele), and 1 case for the exact identification of the ABO blood type due to inconsistent serological results.

2.ABO 불일치 원인

후향적으로 분석한 339건의 ABO 불일치 원인을 Table 2에 정리하였고, 불일치 원인별 대표 사례를 Table 3에 제시하였다. ABO 불일치를 보이는 검체는 238개였으나(Table 1), 복수의 불일치 원인을 갖는 검체들이 존재하여 총 339건의 불일치 원인이 확인되었다. 적혈구 항원의 과잉 반응(extra red cell reactivity)은 9건이었고, 자가 응집소가 1.5% (5/339), 골수 이식이 0.6% (2/339), 파라단백혈증이 0.3% (1/339), 그리고 원인 불명이 0.3% (1/339) 있었다. 적혈구 항원 약화(weak or missing red cell reactivity)는 175건이었고, ABO 아형이 30.1% (102/339), 원인 불명이 18.3% (62/ 339), 혈액암이 3.2% (11/339) 있었다. 혈액암 중 급성골수성백혈병이 6건, 골수형성이상증후군이 5건을 차지하였다. 혈청 측 과잉 반응(extra serum reactivity)은 121건이었고, ABO 아형이 26.8% (91/339), 비예기항체가 6.2% (21/339), 원인 불명이 2.7% (9/339) 있었다. 혈청 측 반응 약화(weak or missing serum reactivity)는 34건이었으며, 원인 불명이 8.6% (29/339)로 가장 많았고, 골수 이식이 0.9% (3/339), 어린 나이로 인해 동종응집소 역가가 낮은 경우가 0.6% (2/339) 있었다.

Table 2

Possible causes of ABO discrepancy in 238 cases

Category		Possible causes	% (N)
RBC	Extra reactivity (N=9)	Auto-agglutinins	1.5 (5/339)
		BMT	0.6 (2/339)
		Paraproteinemia	0.3 (1/339)
		Unknown	0.3 (1/339)
	Weak or missing reactivity (N=175)	ABO subgroup	30.1 (102/339)
		Unknown	18.3 (62/339)
		Hematologic malignancy	3.2 (11/339)
Serum	Extra reactivity (N=121)	ABO subgroup	26.8 (91/339)
		Unexpected antibody†	6.2 (21/339)
		Unknown	2.7 (9/339)
	Weak or missing reactivity (N=34)	Unknown	8.6 (29/339)
		BMT	0.9 (3/339)
		Age-related (young age)	0.6 (2/339)
Total			339*

*Some cases revealed multiple causes of ABO discrepancy. Hence, a total of 339 causes were found in 238 ABO discrepant cases.

^†ABO discrepancy due to unexpected antibodies comprised 5 cases with autoantibodies, 5 cases with anti-M, 4 cases with anti-P1, 4 cases with unidentified alloantibodies, 1 case with a cold autoantibody, 1 case with an anti-N, and 1 case with a coexisting anti-P1 and cold autoantibody.

Abbreviations: BMT, bone marrow transplantation; RBC, red blood cell.

Table 3

Representative cases of an ABO discrepancy resolved by ABO genotyping

Case No.	Cell typing				Serum typing			Phenotype	Genotype	Interpretation	Identified cause of ABO discrepancy
	Anti-A	Anti-B	Anti-A1		A-cell	B-cell	Auto
1	±	±	–		4＋	4＋	＋	AwBw	O.01.02/O.01.02	Extra red cell reactivity	Auto-agglutinin
2	+	4+	+		2+	-	＋	AwBw	B.01/B.01		Paraproteinemia due to MM
3	3＋	–	–		–	4＋	–	Aw	AW.36/O.01.01	Weak red cell reactivity	ABO subgroup
4	2＋	–	–		–	3＋	–	Aw	A1.02/A1.02		Hematologic malignancy (AML)
5	–	–	NT		4＋	–	NT	O*	BW.variant†/O.01.06		ABO subgroup & hematologic malignancy (MDS)
6	4＋	4＋	–		–	2＋	–	A2B	cisAB.01/O.01.01	Extra serum reactivity	ABO subgroup
7	4＋	–	4＋		＋	3＋	–	A1	A1.02/A1.02		Unexpected antibody (anti-M)
8	–	–	–		2＋	–	–	O	O.01.01/O.01.01	Weak serum reactivity	Age-related (6 months old)
9	–	–	–		–	4＋	–	O	O.01.01/O.01.01		BMT (A＋→O＋)‡

*Adsorption elution test was positive on B antigen.

^†BW.variant allele refers to the B.01 allele with g.10925C>T, according to the reference sequence NG_006669.2.

^‡Recipient blood type was A＋ and donor blood type was O＋.

Abbreviations: AML, acute myeloid leukemia; BMT, bone marrow transplantation; MDS, myelodysplastic syndrome; MM, multiple myeloma; NT, not tested.

3.ABO 아형의 분포

ABO 아형 대립 유전자 108개의 종류와 ABO 유전자 부위를 Fig. 1에 정리하였다. Cis-AB형 대립 유전자 86건, A 아형 대립 유전자 10건, 그리고 B 아형 대립 유전자 12건을 확인하였다. A 아형의 대립 유전자 중 A1.01에 추가적으로 c.669G>C 변이를 갖는 1건은 Avariant로 표기하였다. B 아형의 대립 유전자 중 B.01에 추가적으로 인트론 1 ＋5.8 kb 부위의 NG_006669.2:g.10925C>T 변이[10]가 2건에서 관찰되었는데, ISBT 명명법에 등록되지 않아 BW.variant로 표기하였다. B.01에 추가적으로 c.503G>A 변이를 갖는 1건은 BW.xx로 표기하였다. 

Fig. 1. 108 ABO subgroup alleles were discovered in this study. *BW.xx allele refers to the B.01 allele with c.503G>A, according to the reference sequence NG_006669.1.

ABO 유전형 분석은 개인 식별, 친자 감별, 다양한 질환과의 연관성 분석 등에도 사용되어 왔지만[15-21], 의료기관에서는 주로 ABO 아형의 규명과 ABO 불일치 해결에 활용되어 왔다. 본 연구에서는 상급 종합병원의 단일 기관에서 시행한 ABO 유전형 검사의 의뢰 목적과 검사 결과를 분석하였다. Won 등[12]에서 ABO 유전형 검사의 목적이 205 검체 중 77.1% (158/205)는 ABO 불일치 및 ABO 아형의 규명이라고 보고하였다. 본 연구에서도 89.8% (238/265)에서 ABO 불일치 현상이 관찰되었으며, 불일치하지 않는 사례들 중 가장 많은 경우는 의뢰 사유 파악이 어려운 경우였다. 그 다음은 ABO 아형의 가족 조사로 의뢰된 경우였다(Table 1). 국내 의료기관에서 ABO 유전형 검사를 ABO 아형 규명을 통한 ABO 불일치 해결에 주로 활용됨을 다시 확인할 수 있었다.

AABB에 의하면 ABO 불일치 원인은 적혈구 항원의 과잉 반응, 적혈구 항원 약화, 혼합 시야 반응, 혈청 측 과잉 반응, 그리고 혈청 측 반응 약화의 5가지 항목들로 분류할 수 있다. Heo 등[1]이 삼성서울병원에서 약 3년 간 발생한 ABO 불일치 1,334건을 분석한 결과, 혈청 측 반응 약화가 40.5% (594/1334)로 가장 많았고, 혈청 측 과잉 반응이 25.2%, 적혈구 항원 약화가 18.2%, 혼합 시야 반응이 12.0%, 그리고 혈청 측 과잉 반응이 4.2%였다. 그런데, 본 연구에서는 적혈구 항원 약화가 51.6% (175/339)로 가장 많았고, 다음으로 혈청 측 과잉 반응이 35.7%였다(Table 2). 이러한 차이는 Heo 등[1]의 연구는 혈청학적으로 ABO 불일치를 보인 모든 검체를 그 대상으로 하였지만, 본 연구에서는 ABO 유전형 검사를 시행한 검체만을 대상으로 하였기 때문이다.

ABO 유전형을 활용해 ABO 불일치를 해결할 때, 환자의 임상정보를 반드시 참고해야 한다. Yu 등[10]이 보고한 바에 따르면, BW.varian t (B.01 allele with g.10925C>T)를 대립 유전자로 갖는 한국인 환자는 anti-B에 2＋∼3＋ 응집 반응을 보였다. 그러나 동일한 대립 유전자를 갖는 Table 3의 사례 5는 anti-B에 반응이 전혀 없어, 기존 보고에 비해 B 항원이 더 약화된 것을 알 수 있었다. 추후 흡착 해리 검사를 통해 B 항원의 존재가 확인되었다. 이러한 현상은 당시 환자 병력인 골수형성이상증후군에 의한 추가적인 항원 약화로 설명이 가능했다. 또한 Cho 등[2]에 따르면, anti-A가 anti-B보다 역가가 높은 경우가 흔하기 때문에, 사례 8와 같이 O형 영아 및 면역저하자에서 anti-B가 anti-A보다 먼저 검출한계 이하로 감소하는 현상이 발생할 수 있다. 반면, 사례 9에서는 anti-A가 검출한계 이하로 감소하고, anti-B가 정상이었는데, 이는 드문 현상이므로 면역저하 외 다른 원인을 생각해봐야 한다. 환자는 A형이었고, O형의 골수를 이식받았던 과거력이 있었으며, 유전형 O.01.01/O.01.01이 확인되어 ABO 불일치 원인을 ABO 부적합 골수 이식으로 결론지었다. 이처럼 ABO 유전형 검사 해석 시, 상병명, 골수 이식 과거력 등 환자의 임상정보를 충분히 파악하는 것이 중요하다.

한편, ABO 유전형 검사를 실시하여도 일부 검체는 ABO 아형의 원인 유전자를 규명하지 못했다. Won 등[12]은 약해진 표현형 원인 규명을 위해 ABO 유전형 검사가 의뢰되었지만 그 유전적 원인을 ABO 유전자 엑손 6과 7의 분석으로 밝힐 수 없는 경우가 29.1% (46/158)였다고 보고하였다. Lee 등[22]도 한국인에서 B3형 13명을 대상으로 ABO 유전자 전체 엑손(1∼7번) 분석을 통해 한국인 B3형의 특이대립유전자를 규명하고자 하였는데, 단 1예에서만 Bw03/O01 유전형이었고, 12예 중 11예가 B101/O01 혹은 B101/O02 유전형이었다. 이러한 결과는 비록 ABO 유전자의 전체 엑손을 분석한다고 하더라도 B3형에서 특이대립유전자가 대부분 검출되지 않음을 의미한다. 그런데, 최근 기존 ABO 유전형 분석의 한계점이 중국, 일본, 한국인에서 CCAAT-binding factor (CBF)/ NF-Y 결합 부위, 근접 프로모터, 인트론 1 ＋5.8 kb 부위 등의 ABO 유전자 조절 부위(regulatory region) 분석을 통해 일부 극복되었다[5-10]. 한국인에서 A 항원을 약화시키는 것으로 밝혀진 조절 부위 변이로 근접 프로모터의 NG_006669.2:g.4944C>T, g.4954G>T와 인트론 1 ＋5.8 kb 부위의 NG_006669.2:g.10843T>C, g.10935C>T가 보고되었고, B 항원 약화를 유발하는 변이로는 근접 프로모터의 NG_006669.2:g.4991_5008del와 인트론 1 ＋5.8-kb 부위의 NG_006669.2:g.10893G> A, g.10925C>T가 보고되었다[9,10]. 상기 보고된 변이들은 ABO 유전자의 전사활성도를 감소시켜 항원 약화를 유발하는 것으로 생각된다[9,10,23]. 본 연구에서 근접 프로모터 부위의 변이는 발견되지 않았고, 인트론 1 ＋5.8 kb 부위의 변이인 g.10925C>T만 2건 관찰되었다. 이는 본 검사실에서 근접 프로모터 및 인트론 1 ＋5.8 kb 부위를 추가로 분석한 기간이 짧고 검사 건수도 17건 뿐으로 적기 때문이다. 향후 보다 많은 검사를 시행하면 근접 프로모터 부위의 변이도 관찰될 것으로 추정된다.

본 연구에서 확인한 ABO 아형 대립 유전자의 빈도(Fig. 1)는 ABO 유전형 검사가 의뢰된 검체들을 대상으로 분석한 것이므로 전체 한국인 인구집단에서의 빈도를 대변하지 못하며 역학 자료로 활용하기에 적절하지 않다.

본 연구에서는 최근 5년 간 삼성서울병원에 의뢰된 265건의 ABO 유전형 검사 결과를 분석하였다. 이 중 238건에서 ABO 불일치가 발견되었고, 총 339건의 ABO 불일치 원인을 분류해본 결과, 적혈구 항원의 약화(weak red cell reactivity)가 51.6% (175/339), 혈청 측 과잉 반응(extra serum reactivity)이 35.7% (121/339)로 흔했다. ABO 불일치의 유전적 원인을 최대한 파악하기 위해 ABO유전자의 엑손 6, 7 이외에 조절 부위를 추가로 분석하였다. 분석 기간이 짧았다는 한계점이 있음에도 불구하고, 인트론 1 ＋5.8 kb 부위의 g.10925C>T변이를 2건 확인하였고, 이를 통해 추가적인 ABO 불일치 해결이 가능했다. 이러한 5년 간 ABO 유전자 검사 경험을 통해 ABO 유전형 검사는 ABO 불일치의 원인 및 ABO아형의 대립유전자 규명에 도움됨을 알 수 있었다. 

배경: ABO 유전형 검사는 혈청학적 검사로 정확한 ABO 혈액형 규명이 불가능할 때 시행한다. 통상 ABO 유전자의 엑손 6, 7만 분석했으나, 본 검사실에서는 근접 프로모터 및 인트론 1 ＋5.8 kb 부위에 대한 추가 분석을 도입하였다. 이에 최근 5년간의 경험을 바탕으로 ABO 유전자 분석의 임상적 활용과 ABO 아형의 분포를 새롭게 보고하고자 한다.

방법: 2017년 8월부터 2022년 7월까지 삼성서울병원에서 ABO 유전형 검사를 시행한 총 265건의 검체를 후향적으로 분석하였다. 모든 검체는 혈청학적 ABO 혈액형 검사와 엑손 6, 7의 직접염기서열분석을 시행하였고, 17개 검체는 ABO 유전자의 조절 부위를 추가 분석하였다. 일부 사례는 복수의 원인을 갖고 있었고, ABO 불일치 238건에서 확인된 339건의 불일치 원인을 분석하였다.

결과: 총 265건의 검체 중 89.8% (238/265)가 ABO 불일치를 보였다. 적혈구 항원 약화(51.6%, 175/339)가 가장 흔한 원인이었고, 그 다음은 혈청 측 과잉 반응(35.7%, 121/339)이었다. 전체 검체 중 40.8% (108/265)가 ABO 아형으로 확인되었다. 108건의 ABO 아형 대립 유전자 중 엑손 6과 7부위에서 cisAB.01이 82건(75.9%, 82/108) 차지하였고, 인트론 1 ＋5.8 kb 부위의 g.10925C>T가 2건 확인되었다.

결론: 최근 5년간의 ABO 유전형 검사 경험을 통해 ABO 불일치의 원인과 ABO 아형의 대립유전자를 규명할 수 있었다. ABO 유전자 조절 부위에 대한 확장된 분석은 적혈구 항원 약화로 인한 ABO 불일치를 더 잘 이해하는 데 도움이 되었다.

저자들은 본 연구와 관련하여 어떠한 이해관계도 없음을 밝힙니다.