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Freezing and Washing of Red Blood Cells Using Haemonetics ACP 215
Haemonetics ACP 215를 이용한 적혈구의 동결과 세척
Korean J Blood Transfus 2018;29:291−300
Published online December 31, 2018;  https://doi.org/10.17945/kjbt.2018.29.3.291
© 2018 The Korean Society of Blood Transfusion.

Kyoung Won Youn1, Kyoung Young Choi2, Sun Ah Lee3, Hyuk Ki Min1, and Jaehyun Kim1
윤경원1, 최경영2, 이선아3, 민혁기1, 김재현1

1Blood Transfusion Research Institute, Korean Red Cross, Wonju,
2Jungbu Blood Laboratory Center, Korean Red Cross, Daejeon, Korean,
3Department of Laboratory Medicine, Myongji St. Mary’s Hospital, Seoul, Korean
1대한적십자사 혈액수혈연구원,
2대한적십자사 중부혈액검사센터,
3명지성모병원 진단검사의학과
Jaehyun Kim Blood Transfusion Research Institute, Korean Red Cross, 50 Hyeoksin-ro, Wonju 26465, Korea Tel: 82-33-811-0221, Fax: 82-33-811-0240, E-mail: kimjh@redcross.or.kr, ORCID: http://orcid.org/0000-0002-9494-156X
Received September 7, 2018; Revised October 16, 2018; Accepted October 30, 2018.
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Abstract

Background:

The use of a functionally closed system for the glycerolization and deglycerolization of red blood cells (RBCs) allows for prolonged post-thaw storage for more than 24 hours. The aim of this study was to assess glycerolization and deglycerolization processing for RBCs using a high glycerol method in the automated, closed system provided by Haemonetics ACP 215.

Methods:

Thirty-five packed RBCs were glycerolized using the ACP 215 to a final concentration of 40% (wt/vol). The units were either frozen as such (n=30) or excess glycerol was removed (n=5) before freezing. After storage at –80°C, the units were thawed, deglycerolized and resuspended in SAG-M. The frozen-thawed RBCs were stored at 4°C, and analyzed for their stability and in vitro quality.

Results:

No prefreeze excess glycerol removal units showed significantly less potassium leakage during post-thaw storage compared to the prefreeze excess glycerol removal units. All measurements of the stability and in vitro quality of thawed RBCs prepared from frozen RBCs without the prefreeze removal of excess glycerol during post-thaw storage at 4°C for 7 days were acceptable to the American Blood Bank Association’s standards and European standards.

Conclusion:

RBCs frozen without prefreeze removal of excess glycerol and the ACP 215 simplifies cryopreservation procedure and increases the stability of frozen-thawed RBCs. This increases the practical applicability of cryopreserved RBCs in blood transfusion practice.

Keywords : Red blood cells, Cryopreservation, Glycerolization, Deglycerolization
서 론

적혈구를 동결하여 장기간 보존하는 방법은 1950년 Smith [1]에 의해 동결보호제인 글리세롤을 첨가하여 최초로 고안된 이후 많은 연구가 이루어졌다. Valeri 등[2]은 2005년에 적혈구에 글리세롤의 최종농도가 약 40% (wt/vol)가 되도록 첨가하여 동결하는 고농도글리세롤(high glycerol method)법과 Haemonetics ACP 215 (Haemonetics, Braintree, MA, USA) 장비를 이용하여 폐쇄계(closed system)에서 자동으로 글리세롤을 주입하여 적혈구를 동결하고, 탈글리세롤(deglycerolization)하여 세척하는 시스템을 보고한 이후 동결해동적혈구의 실용성 및 유용성이 높아졌다.

적혈구의 동결과 해동, 세척이 개방계(open system)에서 이루어지는 경우 그 유효기간은 24시간 이지만, 폐쇄계에서 적혈구를 자동으로 동결하고 해동하여 세척하는 경우에는 saline-adenine-glucose-mannitol (SAG-M)을 보존액으로 사용할 때 해동 후 7일, additive solution-3 (AS-3)를 사용할 때 14일까지 보존기간 연장이 가능하다[3-6].

현재 많은 해외 선진혈액사업국가에서는 희귀혈액의 공급 또는 전시ㆍ사변, 대규모 자연재해 등 국가적 비상사태 시 필요한 혈액제제를 공급하기 위하여 동결혈액프로그램을 운영하고 있다. 따라서 국내에서도 희귀혈액의 공급이나 국가적 비상사태에 대비하여 혈액을 동결하여 장기 보관할 필요성이 있을 것으로 생각된다. 본 연구에서는 향후 국내에 동결혈액보관시스템이 도입될 것을 대비하여 고농도글리세롤법과 동결적혈구 제조 및 해동의 자동화 기기인 ACP 215를 이용한 동결해동적혈구 제조의 프로토콜 확립과 여러 가지 기술적인 문제점을 점검하여 동결혈액 관리의 기초자료로 활용하고자 하였다.

대상 및 방법

1. 연구용 혈액

연구용 혈액은 전혈 400 mL에서 분리된 농축적혈구제제로 헌혈혈액선별검사 결과 ALT 65 IU/L 이상으로 폐기 대상인 혈액 중 채혈 후 6일이 경과하지 않은 혈액 35단위를 사용하였으며, 본 연구는 대한적십자사 생명윤리심의위원회로부터 승인을 받은 후 진행하였다(IRB No. 17-1차-정-8).

2. 동결적혈구의 제조

냉장 보관해 두었던 농축적혈구제제를 37°C 진탕항온수조에서 10분간 두어 표면온도가 적외선 온도계로 측정하여 20∼30°C가 되도록 방치하였다. 혈액의 온도가 등온화 되면 농축적혈구가 포함되어 있는 혈액백을 무균백줄봉합기(sterile connection device, SCD)를 사용하여 2 L 용량의 RBC Freezing Bag (Fresenius Kabi, Lake Zurich, IL, USA)과 연결하고, 혈액을 RBC Freezing Bag으로 옮겨 담았다. ACP 215 장비에 glycerolization disposable set LN225 (Haemonetics, Braintree, MA, USA)와 57.1% 글리세롤 용액(S.A.L.F. S.p.A. Laboratorio Farmacologico, Bergamo, Italy)을 장착하고, SCD를 이용하여 무균적으로 혈액과 연결한 후 혈액은 ACP 215와 연결되어 있는 진탕기 위에 올려 놓았다.

ACP 215에 혈액의 무게를 입력하고 혈액무게에 따라 장비가 자동적으로 글리세롤을 최종농도 40±4% (w/v)로 주입하도록 미리 설정되어 있는 프로그램을 구동하여 장비를 작동하였다. 글리세롤 주입이 완료된 30단위의 혈액은 Lelkens 등[7]의 방법에 의하여 동결 전 잔여 글리세롤을 제거하지 않고 초기 24시간 동안은 –80°C 냉동고의 바닥에 넓은 면이 닿도록 하여 냉동시키고(no prefreeze volume reduction frozen red blood cell, no-PFVR FRBC) 그 이후에는 보관용 트레이에 넣어 포개어 보관하였다. 또한 글리세롤 주입이 완료된 혈액 중 5단위는 Valeri 등[2]의 방법에 따라 동결 전 잔여 글리세롤을 제거하기 위하여 RBC Freezing Bag에 600 mL waste bag을 무균적으로 연결한 후 22°C에서 1,248x g에서 10분간 원심 분리하고, 혈장추출기를 사용하여 상층의 글리세롤을 waste bag으로 옮겨 제거하였다. 제조한 혈액은 초기 24시간 동안은 –80°C 냉동고의 바닥에 넓은 면이 닿도록 하여 냉동시키고(prefreeze volume reduction frozen red blood cell, PFVR FRBC) 그 이후에는 보관용 트레이에 넣어 포개어 보관하였다.

3. 동결적혈구의 해동 및 세척

–80°C에서 120일 보존한 동결적혈구는 32±2°C 진탕항온수조에서 35분간 두어 혈액제제 표면의 온도가 적외선온도계로 측정하여 30∼34°C 되면 적합한 것으로 판단하고 세척을 실시하였다. 동결해동적혈구의 세척을 위해 우선 ACP 215에 deglycerolization disposable set LN235 (Haemonetics, Braintree, MA, USA), 12% NaCl 용액(Bioluz Laboratoire Pharmaceutique, Saint-Jean-de-Luz, France), 0.9% saline/0.2% dextrose 용액(Bioluz Laboratoire Pharmaceutique, Saint-Jean-de-Luz, France), SAG-M preservative solution (Haemonetics, Braintree, MA, USA)을 장착하였다. SCD를 이용하여 LN235와 항온수조에서 해동한 적혈구를 무균적으로 연결한 후 혈액은 ACP 215와 연결되어 있는 진탕기 위에 올려 놓았다. ACP 215에 해동적혈구의 무게와 적혈구용적률(hematocrit)을 입력하고, 입력된 값에 따라 장비가 자동적으로 12% NaCl, 0.9% saline/0.2% dextrose, SAG-M 용액을 단계적으로 주입하여 세척하도록 미리 설정되어 있는 프로그램을 구동하여 장비를 작동하였다.

동결해동적혈구의 세척을 위해서 우선 12% NaCl 용액 50 mL을 주입하고 이어서 PFVR FRBC의 경우 ACP 215 세척 프로그램의 기본 설정값 대로 0.9% saline/0.2% dextrose 용액 340 mL을 60 mL/min의 유속(flow rate)으로, PFVR FRBC의 경우에는 0.9% saline/0.2% dextrose 용액 600 mL을 110 mL/min의 유속으로 1차 희석하고 농축하는 등 총5회의 세척과정을 수행하였다. 마지막 세척단계에서 Color Comparator (Haemonetics, Braintree, MA, USA)의 표시 색상 중 5번 이하가 되면 세척이 완료된 것으로 판정하고 SAG-M용액 240 mL을 주입하였다.

4. 동결해동적혈구의 품질평가

동결해동적혈구의 품질은 동결적혈구를 해동ㆍ세척한 직후, 세척 후 3일, 7일이 경과한 시점에서 측정하였다.

1) 적혈구 회수율 및 용혈률

적혈구 냉동 전 및 해동적혈구 세척 직후 일반혈액검사(CBC, complete blood count)용 검체 1 mL을 무균적으로 채취하였다. 적혈구 수와 적혈구용적률은 자동혈구계산기 Sysmex KX-21N (Sysmex Corporation, Kobe, Japan) 장비로 측정하고 다음과 같이 적혈구 회수율 및 용혈률을 산출하였다.

RBC recovery rate(%)=Post - washing Hct × volumePre - freezing Hct × volume ×100Hemolysis (%) = PlasmaHb × (100-%Hct)Total Hb
2) 혈장 K+, 혈장 Hb 및 삼투압 측정

혈장 K+, Hb 은 동결해동적혈구 세척 직후, 세척 후 3일 및 7일이 경과한 후에 측정하였다. 동결해동적혈구 상층액에서 K+ 농도와 삼투압은 검사를 시행하는 수탁검사기관에 검사를 의뢰하여 측정하였다. SAG-M 용액에 글리세롤의 최종농도가 0.5∼5% 되도록 첨가한 실험을 5회 반복한 후 삼투압을 측정하여 SAG-M 용액에서 글리세롤 농도에 따른 삼투압을 계산하였다. 혈장 Hb 측정을 위하여 혈액백에서 sampling site coupler (Baxter Healthcare corporation, Deerfield, IL, USA)를 통해 무균적으로 채취한 2 mL 검체를 2,000 g에서 10분간 원심 분리 후, 분리한 혈장 200 μL와 0.942 mol/L Na2CO3 용액 2 mL을 혼합(1:10 희석)하여 Spectra Max Plus 384 (Molecular Devices, CA, USA) 장비를 이용하여 415 nm, 450 nm, 700 nm 파장에서 각각 흡광도를 측정하였다. 혈장 Hb의 농도는 Fairbanks 등[8]의 방법에 따라 아래와 같은 수식으로 계산하였다.

PlasmaHb (mg/dl)=155A415130A450124A700
3) 가상수혈(simulated transfusion)

동결해동적혈구의 실제 수혈 시 적혈구의 파괴 정도를 예측하기 위한 가상수혈은 세척이 완료된 해동적혈구 0.5 mL을 생리식염수 10 mL에 혼합하고 2,000 g에서 10분간 원심 분리 후, 분리한 상층액을 Spectra Max Plus 384 장비를 이용하여 415 nm, 450 nm, 700 nm 파장에서 각각 흡광도를 측정하였다. 상층액의 자유혈색소(free hemoglobin)는 혈장 Hb의 농도와 동일한 방법으로 Fairbanks 등[8]의 수식에 따라 계산하고, 용혈률을 산출하였다.

4) 미생물 배양 검사

세척이 완료된 직후 동결해동적혈구에서 10 mL의 검체를 무균적으로 채취하여 40 mL의 BacT/ALERT SA 배양액 과 40 mL의 BacT/ALERT SN 배양액(bioMérieux, Marcy I’Etoile, France)에 각각 5 mL씩 접종하고 BacT/ALERT 3D에서 14일간 배양하여 검사하였다.

5. 통계분석

통계학적 분석을 위해서는 Microsoft Excel 2007 (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA) 소프트웨어를 사용하였다. 동결 전 잔여 글리세롤을 제거한 그룹과 제거하지 않은 그룹간의 비교는 paired t-test를 사용하였고, P<0.05를 통계학적으로 유의한 차이가 있는 것으로 간주하였다.

결 과

동결해동적혈구 35단위 모두에서 동결, 해동 및 세척과정 상 혈액의 유출이나 혈액백의 손상은 발견할 수 없었고, 미생물 배양검사결과는 모두 음성이었다.

No-PFVR FRBC의 동결 전 평균용량은 229.6±10.6 mL, 총 혈색소 함량은 56.3±3.1 g 이었고, PFVR FRBC의 동결 전 평균용량은 242.8±15.6 mL, 총 혈색소 함량은 60.1±3.4 g 이었다. 적혈구에 동결보호제인 글리세롤을 투여한 뒤 적혈구의 용량은 예상했던 대로 no-PFVR FRBC는 644.8±36.1 mL으로 PFVR FRBC의 287.6±21.5 mL에 비해 크게 늘어났으며 적혈구용적률은 PFVR FRBC의 70.4±4.3%에 비해 no-PFVR FRBC에서 30.5±1.6%로 낮게 나타났다. 또한 세척용액에 의한 혈색소 손실이 no-PFVR FRBC에서 더 많이 발생하여, 결과적으로 세척이 완료된 동결해동적혈구의 혈색소 함량과 적혈구용적률이 no-PFVR 방법의 동결해동적혈구가 PFVR 방법의 동결해동적혈구 보다 낮게 나타났다(Table 1).

Comparison of (de) glycerolized red blood cells with and without prefreeze volume reduction by the removal of excess glycerol after glycerolization

 Parameters No-PFVR1 units (n=30) PFVR2 units (n=5)
Prefreeze RBC
 Volume (mL) 229.6±10.6 242.8±15.6
 Total Hb (g) 56.3±3.1 60.1±3.4
Glycerolized RBC
 Volume (mL) 644.8±36.1 287.6±21.5*
 Hematocrit (%) 30.5±1.6 70.4±4.3*
 Total Hb (g) 53.3±2.8 56.4±3.4
Deglycerolized RBC
 Volume (mL) 307.3±2.4 308.3±1.6
 Hematocrit (%) 45.3±2.5 50.8±1.7*
 Total Hb (g) 43.9±2.8 48.5±3.0*
 Plasma Hb (mg/dL) 4.4±1.9 4.5±2.1
 RBC recovery (%) 81.5±4.7 85.6±2.4
 Supernatant osmolarity (mOsm/Kg·H2O) 339.2±22.3 347.8±14.1
 Simulated transfusion (%) 0.18±0.08 0.16±0.05
 Sterility No growth No growth

No-PFVR, No prefreeze volume reduction;

PFVR, prefreeze volume reduction; RBC, red blood cells; Hb, hemoglobin.

* Data are reported as mean±SD.

* Significantly different (P<0.05, Student’s t-test) from the values obtained with prefreeze removal of excess glycerol.



세척이 완료된 해동적혈구의 세척 정도를 평가하기 위한 지표로서 삼투압은 혈액을 보존하는 용액에 따라 그 기준이 달라질 수 있기 때문에 본 연구에서 사용된 혈액보존액인 SAG-M 용액에서 글리세롤 농도에 따른 삼투압을 측정하였다. 그 결과 글리세롤이 전혀 들어 있지 않은 SAG-M 용액의 삼투압이 344.8±1.5 mOsm/Kg·H2O 이었으며, SAG-M 용액에 글리세롤이 최종농도 1%로 포함되어 있을 때 454.2±4.0 mOsm/Kg·H2O 이었다(Fig. 1).

Fig. 1.

Standard curve for the osmolarity of glycerol in SAG-M. A standard curve was prepared by making serial dilutions of glycerol in SAG-M within a range of concentrations near the expected concentrations of the unknown samples and tested triplicate.



세척이 완료된 해동적혈구 상층액의 삼투압은 no-PFVR FRBC 의 경우 339.2±22.3 mOsm/Kg·H2O, PFVR FRBC 의 경우 347.8±14.1 mOsm/Kg·H2O 이었으며, 두 그룹 모두 잔여 글리세롤 농도 1% (wt/vol)에 해당하는 삼투압 454.2±4.0 mOsm/Kg·H2O을 초과하는 혈액은 없었다. 동결해동적혈구에서 평균 적혈구회수율은 no-PFVR FRBC의 경우 81.5±4.7% (범위: 76.8∼86.2%)이었고 PFVR FRBC 의 경우 85.6±2.4% (범위: 83.2∼88.0%) 이었다. 한편 가상수혈 시 no-PFVR 방법의 동결해동적혈구는 상층액의 자유혈색소가 14.6±6.4 mg/dL로서 0.18±0.08%의 용혈을 보였으며, PFVR 방법의 동결해동적혈구는 상층액의 자유혈색소가 16.2±5.4 mg/dL 로서 0.16±0.05%의 용혈을 보였다(Table 1).

세척이 완료된 후 SAG-M 용액에 부유한 동결해동적혈구를 4°C에서 보존하면서 세척직후, 세척 후 3일 및 7일이 경과한 시점에서 측정한 K+ 및 용혈률은, no-PFVR 방법으로 동결하고 해동한 동결해동적혈구에서 세척 직후 K+ 농도는 3.5±0.8 μmol/g·Hb (0.5±0.1 mmol/L), 보존 3일 및 7일 뒤는 43.1±7.5 μmol/g·Hb (6.2±1.4 mmol/L) 및 77.3±11.9 μmol/g·Hb (11.3±2.0 mmol/L), 용혈률은 세척직후 0.1±0.0%, 보존 3일 및 7일 뒤는 0.3±0.1% 및 0.6±0.2%로 증가하였다. 반면 PFVR 방법으로 동결하고 해동한 동결해동적혈구에서는 세척 직후 K+ 농도가 5.5±1.5 μmol/g·Hb (0.9±0.2 mmol/L), 보존 3일 및 7일 뒤는 112.2±16.8 μmol/g·Hb (18.0±3.3 mmol/L) 및 160.6±22.8 μmol/g·Hb (26.1±4.3 mmol/L), 용혈률은 세척직후 0.0±0.0%, 보존 3일 및 7일 뒤는 0.2±0.1% 및 0.6±0.1%로 증가하여 용혈률 증가 양상은 두 방법이 동일하였으나, 보존기간 경과에 따른 K+ 유출은 no-PFVR 방법으로 동결하고 해동한 동결해동적혈구 보다 PFVR 방법으로 동결하고 해동한 동결해동적혈구에서 증가 폭이 크게 나타났다(Fig. 2).

Fig. 2.

In vitro quality of frozen-thawed red blood cells during storage in SAG-M. Red blood cells were either frozen with (□) or without (■) prefreeze removal of excess glycerol. After thawing and deglycerolization of frozen red blood cells, the red blood cells were resuspended in SAG-M, stored at 4oC and analyzed for in vitro quality parameters: (A) hemolysis and (B) supernatant potassium. The results given are the mean and standard deviation of 5 units for without prefreeze removal and 30 units for prefreeze removal of excess glycerol. *Significantly different (P<0.05, Student’s t-test) from the values obtained with prefreeze removal of excess glycerol.


고 찰

CPDA-1 항응고 보존액에 보존한 적혈구는 채혈 후 1∼6°C에서 35일간 보존할 수 있으며, 적혈구를 동결하여 보관할 경우 적혈구의 보존기간을 10년 이상 최대 37년까지 연장할 수 있는 것으로 보고되고 있다[9]. 그러나 적혈구를 동결하여 보관하면 적혈구는 화학적, 열화학적, 기계적 힘에 노출되어 수혈 후 산소운반 능력에 영향을 받을 수 있다.

고농도글리세롤법에 의해 동결된 동결적혈구의 품질은 동결 전 적혈구의 보존기간, 해동 후의 보존기간 및 사용한 보존액이 중요한 영향을 미친다. 또한 글리세롤을 동결보호제로 하여 적혈구를 동결하고, 동결적혈구를 해동할 때 가장 중요한 기술적 요구는 탈글리세롤(deglycerolization), 즉 세척과정인데 글리세롤이 완전히 제거되지 않은 혈액을 인체에 수혈하면 세포 내에 고농도로 존재하는 글리세롤에 의하여 혈장내의 물이 흡수되어 용혈이 일어날 수 있어 용혈성수혈부작용과 신부전(renal failure)을 유발할 수 있기 때문이다[10,11]. 한편 동결해동적혈구의 세척과정은 동결보호제로 사용한 글리세롤을 제거하는 것뿐만 아니라 유해한 생리활성지질(bioactive lipids), 미립자(microparticles), 사이토카인(cytokines), 칼륨, 자유혈색소 및 백혈구도 제거하는 것으로 보고되고 있다[12-14].

동결해동적혈구의 세척과정이 완벽한지 여부를 확인하는 방법으로는 삼투압 측정, 가상수혈(simulated transfusion), 비중 측정 등의 방법이 있다. 해동 후 세척한 적혈구의 상층액에 대해 비중 측정과 삼투압 측정을 시행하여 비중이 1.3384 이하, 잔존 글리세롤의 양이 1% 미만임을 보증하기 위해 삼투압이 400 mOsmol/L 이하면 수혈용으로 적합하다고 판단하고 있다. 과거 유럽연합의 동결해동적혈구 품질관리기준에는 전체 해동된 혈액의 1% (최소 월 4단위)를 무작위 표본 검사하여 삼투압이 340 mOsm/KgㆍH2O 이하가 되어야 한다고 규정하였으나[15], 최근에 개정된 기준에는 삼투압 측정에 따른 잔존 글리세롤의 평가 기준이 혈액을 보존하는 용액에 따라 달라질 수 있기 때문에 혈액을 보존하는 용액의 삼투압 보다 최대 20 mOsm/Kg·H2O 가 초과되지 않도록 개정되었다[16]. 따라서 본 연구에서 사용한 동결해동적혈구 보존액인 SAG-M의 삼투압이 344.8±1.5 mOsm/Kg·H2O 인 점을 감안한다면 364 mOsm/Kg·H2O 이하면 탈글리세롤 조작이 잘 이루어 진 것으로 판단할 수 있겠는데, 본 연구 결과 no-PFVR 및 PFVR 방법으로 제조된 동결적혈구의 해동·세척 후 삼투압은 모두 364 mOsm/Kg·H2O 이하로 측정되었다. 또한 실제 수혈 후 적혈구의 파괴 정도를 예측하는 가상수혈은 탈글리세롤된 농축적혈구 0.5 mL을 생리식염수 10 mL에 섞어 원심분리한 후 상층액의 혈색소치를 측정하여 3% 이하의 용혈을 보이면 탈글리세롤 조작이 잘 이루어진 것으로 판단한다. 한편 세척조작이 충분히 이루어졌는지의 지표로서 K+은 1.5 mEq/L (1.5 mmol/L) 이하이어야 하고, 세척과정 중 마지막 상층액의 혈색소치가 150 mg/dL 이하의 값을 보이면 세척이 충분히 이루어진 것으로 판단한다. 본 연구 결과 no-PFVR 및 PFVR 방법으로 제조된 동결적혈구의 해동·세척 후 삼투압 및 K+이 모두 이 기준치 이하였으며, 가상수혈 결과 허용기준이 3% 이하인데 본 연구 결과 no-PFVR 방법으로 제조된 동결해동적혈구는 0.18±0.08%, PFVR 방법으로 제조된 동결해동적혈구는 0.16±0.05%로 기준치에 비해 상당히 낮게 나타나 실제 수혈 시 적혈구의 파괴 정도가 매우 낮을 것으로 예측되었다.

동결해동적혈구의 용량 및 적혈구회수율의 미국혈액은행협회(American Association of Blood Banks, AABB)의 평가 기준[17]은 적혈구의 회수율이 동결 전 적혈구의 80% 이상이어야 한다. 유럽연합의 기준은 해동된 모든 적혈구의 용량이 185 mL 이상, 상층액의 혈색소치가 혈액제제 1 단위당 0.2 g 이하, 적혈구용적률 35∼70% 이어야 한다고 규정하고 있다[16,17]. 본 연구 결과에서는 no-PFVR 방법으로 제조된 동결적혈구의 해동·세척 후 평균 용량은 307.3±2.4 mL, 적혈구 회수율 81.5±4.7%, 적혈구용적률 45.3±2.5% 이고 PFVR 방법으로 제조된 동결적혈구의 해동·세척 후 평균 용량은 308.3±1.6 mL, 적혈구 회수율 85.6±2.4%, 적혈구용적률 50.8±1.7% 로서 모두 기준에 적합하였다. 또한 상층액의 혈색소치도 두 가지 방법에서 모두 0.2 g 이하로 기준에 적합하였다.

ATP는 모든 생물의 세포 내에 존재하여 에너지 대사에 매우 중요한 역할을 한다. 또한 적혈구 세포막 안쪽의 골격단백질인 스펙트린(spectrin)을 조절하여 세포구조를 유지하는데 중요한 역할을 하는데, 적혈구 내의 ATP 감소는 적혈구 세포막의 경직 등 세포막의 변형을 유발하여 적혈구의 생존력을 저하시킨다[18,19]. 그러므로 일반적으로 채혈 직후 적혈구내의 ATP의 농도가 평균 4±1 μmol/g·Hb 인데 적혈구 수혈 후 24시간 생존률이 75% 이상 이려면 적혈구내의 ATP 함량이 최소한 2.7 μmol/g·Hb가 되어야 하고[20], 동결해동적혈구에서 높은 수준의 ATP의 양을 기대하기 위해서는 적혈구 동결 전 보존 시간을 제한하는 것이 중요하다[4,21].

현재 고농도글리세롤법에 의한 적혈구의 동결방법으로는 Valeri 등[2]의 방법에 의해 동결 전 잔여글리세롤을 제거하는 방법이 가장 널리 사용되고 있으나, 2012년 List 등[22]과 2015년 Lelkens 등[7]이 동결 전 잔여글리세롤을 제거하지 않은 동결적혈구의 해동 후 보존성이 우수하고 잔여글리세롤을 제거하기 위한 원심분리과정이 생략됨에 따라 동결과정의 간소화, 혈액백 파손의 위험이 경감된다는 것이 보고된 이후 유럽과 아시아·태평양 지역을 중심으로 적용이 확대되고 있다. 본 연구에서는 고농도글리세롤법과 ACP 215 장비를 이용하여 적혈구를 동결하고 세척하였는데, 동결해동적혈구의 품질평가 결과가 AABB 및 유럽연합의 기준에 모두 적합하여 향후 우리나라에서 희귀혈액 공급 및 국가적 위기상황에 대비하기 위한 ‘동결혈액보관시스템’ 구축 시 동결적혈구 제조 및 사용에 기술적인 문제는 없을 것으로 생각된다. 그러나 본 연구결과 및 Lelkens 등[7]의 결과에서도 혈액 동결을 위해 동결보호제인 글리세롤을 적혈구에 첨가할 때 포화되지 않은 잔여 글리세롤을 제거하지 않고 바로 동결하는 no-PFVR 방식의 동결법은 동결적혈구의 해동·세척 이후 K+ 등의 지표로 보아 해동 후 보존성이 기존의 PFVR 방식 보다 우수하고, 적혈구 동결과정의 간소화 및 원심분리 등에 의해 혈액에 가해지는 물리력을 감소시킬 수 있는 장점이 있으나, 적혈구 회수율 등에서는 오히려 기존의 PFVR 방식이 보다 우수한 결과를 나타내었다. 또한 no-PFVR 방식의 동결적혈구 부피가 PFVR 방식의 동결적혈구 부피보다 상당히 크므로 동결혈액의 보존관리의 용이성 측면에서 불리한 점이 있다. 따라서 본 연구의 결과와 국내에서 이미 보고된 연구결과[23,24]를 종합하여 볼 때 동결혈액보관시스템이 국내에 도입될 경우 밸리데이션 절차를 통하여 검증한다면 두 방법 중 어느 방법을 선택하여도 무방할 것으로 보인다. 적혈구 동결 및 세척에 사용된 ACP 215 장비는 작동방법이 비교적 간단하고 자동화 되어 있으나 동결해동적혈구의 안전성에는 제조, 해동 및 세척에 작업자의 기술 및 숙련도 역시 중요한 요인으로 작용할 것으로 생각되어 작업자의 기술 및 숙련도를 일정한 수준 이상으로 유지하여야 할 것으로 생각된다.

요 약

배경: 적혈구를 폐쇄계에서 동결하고 세척하는 경우 동결해동적혈구의 보존기간을 24시간 이상으로 연장할 수 있다. 본 연구에서는 고농도글리세롤법과 자동화 장비인 Haemonetics ACP 215를 이용한 폐쇄계에서 적혈구의 동결과 세척과정을 평가하였다.

방법: ACP 215를 이용하여 35단위의 적혈구에 글리세롤을 최종농도가 40% (wt/vol)가 되도록 첨가하고 30단위는 즉시 동결하였으며, 나머지 5단위는 잔여 글리세롤을 제거한 다음 동결하였다. 동결한 적혈구는 –80°C에 보관 후 해동·세척하여 SAG-M 보존액에 부유하고, 4°C에서 보존하면서 안정성 및 품질관리 지표를 분석하였다.

결과: 잔여 글리세롤을 제거하지 않은 동결적혈구는 잔여 글리세롤을 제거한 동결해동적혈구에 비해 해동 후 보존기간 동안 칼륨 유출이 현저히 낮게 나타났다. 잔여 글리세롤을 제거하지 않은 동결해동적혈구를 해동 후 4°C에서 7일간 보존하는 동안 측정한 모든 안정성 및 품질지표는 AABB와 유럽연합의 기준에 모두 적합하였다.

결론: ACP 215를 사용하여 동결 전 잔여 글리세롤을 제거하지 않고 바로 적혈구를 동결하는 방법은 동결보존과정이 단순하고 동결해동적혈구의 안정성이 향상되어 향후 수혈을 위한 동결적혈구에 현실적으로 적용가능성이 높은 것으로 생각된다.

감사의 글

본 연구를 위해 연구용 장비와 시약을 공급하여 주신 헤모네틱스코리아(주) 및 애크미메디칼 관계자 분들께 감사의 뜻을 표합니다. 논문의 저자들은 본 연구에 외부지원 연구비 및 편견이 개입되지 않았으며 이해관계 충돌의 여지가 없음을 밝힙니다.

Acknowledgment
본 연구를 위해 연구용 장비와 시약을 공급하여 주신 헤모네틱스코리아(주) 및 애크미메디칼 관계자 분들께 감사의 뜻을 표합니다. 논문의 저자들은 본 연구에 외부지원 연구비 및 편견이 개입되지 않았으며 이해관계 충돌의 여지가 없음을 밝힙니다.
References
  1. Smith AU. Prevention of haemolysis during freezing and thawing of red blood-cells. Lancet 1950;2:910-1.
    Pubmed CrossRef
  2. Valeri CR, Ragno G, Van Houten P, Rose L, Rose M, and Egozy Y et al. Automation of the glycerolization of red blood cells with the high-separation bowl in the Haemonetics ACP 215 instrument. Transfusion 2005;45:1621-7.
    Pubmed CrossRef
  3. Bandarenko N, Hay SN, Holmberg J, Whitley P, Taylor HL, and Moroff G et al. Extended storage of AS-1 and AS-3 leukoreduced red blood cells for 15 days after deglycerolization and resuspension in AS-3 using an automated closed system. Transfusion 2004;44:1656-62.
    Pubmed CrossRef
  4. Bohonek M, Petrás M, Turek I, Urbanová J, Hrádek T, and Chmátal P et al. Quality evaluation of frozen apheresis red blood cell storage with 21-day postthaw storage in additive solution 3 and saline-adenine-glucose-mannitol: biochemical and chromium-51 recovery measures. Transfusion 2010;50:1007-13.
    Pubmed CrossRef
  5. Lagerberg JW, Truijens-de Lange R, de Korte D, and Verhoeven AJ. Altered processing of thawed red cells to improve the in vitro quality during postthaw storage at 4 degrees C. Transfusion 2007;47:2242-9.
    Pubmed CrossRef
  6. Sen A, and Khetarpal A. Comparative study of automated cryopreservation of red blood cells. Med J Armed Forces India 2013;69:345-50.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  7. Lelkens CC, de Korte D, and Lagerberg JW. Prolonged post-thaw shelf life of red cells frozen without prefreeze removal of excess glycerol. Vox Sang 2015;108:219-25.
    Pubmed CrossRef
  8. Fairbanks VF, Ziesmer SC, and O’Brien PC. Methods for measuring plasma hemoglobin in micromolar concentration compared. Clin Chem 1992;38:132-40.
    Pubmed
  9. Valeri CR, Ragno G, Pivacek LE, Cassidy GP, Srey R, and Hansson-Wicher M et al. An experiment with glycerol-frozen red blood cells stored at -80 degrees C for up to 37 years. Vox Sang 2000;79:168-74.
    Pubmed CrossRef
  10. Cregan P, Donegan E, and Gotelli G. Hemolytic transfusion reaction following transfusion of frozen and washed autologous red cells. Transfusion 1991;31:172-5.
    Pubmed CrossRef
  11. Bechdolt S, Schroeder LK, Samia C, and Schmidt PJ. In vivo hemolysis of deglycerolized red blood cells. Arch Pathol Lab Med 1986;110:344-5.
    Pubmed
  12. Vlaar AP, Kulik W, Nieuwland R, Peters CP, Tool AT, and van Bruggen R et al. Accumulation of bioactive lipids during storage of blood products is not cell but plasma derived and temperature dependent. Transfusion 2011;51:2358-66.
    Pubmed CrossRef
  13. Shanwell A, Kristiansson M, Remberger M, and Ringdén O. Generation of cytokines in red cell concentrates during storage is prevented by prestorage white cell reduction. Transfusion 1997;37:678-84.
    Pubmed CrossRef
  14. Arnaud FG, and Meryman HT. WBC reduction in cryopreserved RBC units. Transfusion 2003;43:517-25.
    Pubmed CrossRef
  15. European Directorate for the Quality of Medicine and HealthCare (EDQM). Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components. Strasbourg, France: Council of Europe; 2015 p. 260-64.
  16. European Directorate for the Quality of Medicine and HealthCare (EDQM). Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components. Strasbourg, France: Council of Europe; 2017 p. 318-23.
  17. Fung MK, Eder AF, Spitalnik SL, and Westhoff CM. Technical manual. Bethesda, Maryland: American Association of Blood Banks; 2017 p. 457-88.
  18. Park Y, Best CA, Auth T, Gov NS, Safran SA, and Popescu G et al. Metabolic remodeling of the human red blood cell membrane. Proc Natl Acad Sci USA 2010;107:1289-94.
    Pubmed CrossRef
  19. Verhoeven AJ, Hilarius PM, Dekkers DW, Lagerberg JW, and de Korte D. Prolonged storage of red blood cells affects aminophospholipid translocase activity. Vox Sang 2006;91:244-51.
    Pubmed CrossRef
  20. van der Meer PF, and Pietersz RN. The effect of plastic overwraps on storage measures of red cell concentrates. Vox Sang 2007;93:176-8.
    Pubmed CrossRef
  21. Lecak J, Scott K, Young C, Hannon J, and Acker JP. Evaluation of red blood cells stored at -80 degrees C in excess of 10 years. Transfusion 2004;44:1306-13.
    Pubmed CrossRef
  22. List J, Horvath M, Leitner GC, and Weigel G. Cryopreservation of red blood cell units with a modified method of glycerolization and deglycerolization with the ACP 215 device complies with American and European requirements. Immunohematology 2012;28:67-73.
    Pubmed
  23. Choi KH, Rhu JH, Park HR, and Kim HO. The preparation of frozen red blood cells and a procedure for deglycerolizing frozen RBCs using COBE 2991 blood cell processor. Korean J Blood Transfusion 2001;12:189-96.
  24. Jung OJ, Kim MJ, Lee MK, Chung HR, Oh DJ, and Lim AH et al. Cryopreservation and thawing of red blood cells using Haemonetics ACP 215. Korean J Lab Med 2005;25:347-51.

 

August 2019, 30 (2)
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